کنترل مثبت و منفی در ایمونوهیستوشیمی

ایمونوهیستوشیمی به طور گسترده‌ای در تحقیقات بیومدیکال برای بومی سازی اپی توپ‌های خاص مولکول‌ها در سلول‌ها و بافت‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. اعتبار تفاسیر مبتنی بر ایمونوهیستوشیمی نیازمند کنترل‌های مثبت و منفی مناسبی است که اغلب در نشریات گزارش نمی‌شوند. این حذف ممکن است منجر به تفاسیر نادرست و نتایج غیرقابل جایگزینی در ادبیات شود و به هدر رفتن زمان، تلاش و منابع و همچنین از بین رفتن اعتماد به تحقیقات علمی توسط عموم مردم، نهادهای قانونگذاری و آژانس‌های مالی کمک کند. مقاله حاضر کنترل‌های ضروری مورد نیاز برای اعتبار سنجی یافته‌های ایمونوهیستوشیمی را خلاصه می‌کند و یک استاندارد عملی برای استفاده از ایمونوهیستوشیمی در تحقیقات  و تحقیقات تشخیصی را نشان می‌دهد. پایبندی به دستورالعمل‌های توصیف‌شده در مقاله حاضر می‌تواند توسط نویسندگان به عنوان پشتیبانی از اعتبار تفاسیر ارائه‌شده در نشریات آن‌ها مورد استناد قرار گیرد.

ایمونوهیستوشیمیایی تفاوتی با هیچ تکنیک دیگری ندارد:
یک روش تجربی که برای آن کیفیت نتایج به طور کامل به آنالیت، معرف‌ها، تکنیک تجربی دقیق، کاربرد صحیح کنترل‌ها و در نهایت تفسیر دقیق داده‌ها براساس تمام عوامل ذکر شده بستگی دارد.

در این مقاله ماهیت ضروری کنترل‌های مناسب در روش ایمونوهیستوشیمی مورد بحث قرار گرفته‌است:

شرط لازم اعتبار سنجی یافته‌های تحقیق، استفاده از کنترل‌های مناسب در طراحی و اجرای آزمایش‌ها و سنجش ها است.متاسفانه، در مورد ایمونوهیستوشیمی، اگر چه نیاز به کنترل به خوبی ثابت شده‌است (باسکین ۲۰۰۹؛ بری ۲۰۰۰، ۲۰۱۰؛ فرورت و همکاران ۲۰۱۳)، این تجربه نویسندگان است که کنترل‌های حیاتی اغلب در نشریات بعدی اجرا یا گزارش نمی‌شوند.
این غفلت منجر به انتشار یافته‌های تایید نشده و غیرقابل حصول در ادبیات شده‌است (کوچمن ۲۰۱۴؛ کالینز و تابک ۲۰۱۴).مشارکت در این مساله این واقعیت است که بسیاری از مجلات با تاثیر بالا که داده‌های ایمونوهیستوشیمی را منتشر می‌کنند، نویسندگان را ملزم به گزارش کنترل‌های ایمونوهیستوشیمی نمی کنند و آنچه که شاید تاسف‌آورتر باشد، کنترل‌هایی که اغلب منتشر می‌شوند نامناسب یا بد تفسیر می‌شوند.با توجه به اینکه کنترل‌ها جز ضروری طراحی آزمایشی در تمام تحقیقات علمی هستند، ما اصرار داریم که تفاسیر معتبر از سنجش‌های ایمونوهیستوشیمی را نمی توان در غیاب کنترل‌های حداقل مناسب انجام داد.علاوه بر این، کنترل‌ها باید شرح داده شوند و در نشریات بعدی گنجانده شوند.
به بیان ساده، یک روش ایمونوهیستوشیمی که فاقد کنترل است را نمی‌توان به طور معتبر تفسیر کرد.
دوره زمانی. به همان اندازه مهم است که نتیجه‌گیری نکنیم که یک مولکول وجود دارد درحالی که در واقع وجود ندارد،همانطور که نتیجه گیری اینکه  که وقتی در واقع وجود دارد، وجود ندارد.هر دو می‌توانند به نتایج علمی اشتباه و تشخیص‌های نادرست بالینی منجر شوند.در هنگام طراحی یک روش ایمونوهیستوشیمیایی، باید احتمال هر دو خطا را در نظر گرفت.

درک این نکته مهم است که کنترل‌ها – چه مثبت و چه منفی – هرگز نمی‌توانند هویت یا وجود یا عدم حضور یک مولکول را در نمونه بافتی با استفاده از تکنیک‌های ایمونوهیستوشیمی اثبات کنند.
با این حال، با کنترل‌های مناسب، محقق می‌تواند یک دلیل قانع کننده ای برای حضور یا عدم حضور یک مولکول بررسی شده بسازد.این بهترین کاری است که می توان انجام داد، اما باید به درستی انجام شود تا معتبر و قابل تکرار باشد.
برای به دست آوردن یک تصویر کلی از “نگرش” بسیاری از مجلات در مورد اهمیت کنترل‌ها در مقالاتی که روش‌های ایمونوهیستوشیمی را در بر می‌گیرند،   نمونه ای از ۲۹ مقاله را  که داده‌های ایمونوهیستوشیمیایی در مجله هیستوشیمی و سیتو شیمی بودندو ۷۱ مقاله دیگر در هشت مقاله دیگر را ببرسی کردیم.مجلات زیست شناسی سلولی و آسیب شناسی که به طور معمول داده ها و تصاویر را براساس ایمونوهیستوشیمی منتشر می کنند.به طور خاص، ما علاقه‌مند بودیم بدانیم که تا چه حد نتایج کنترل به آسانی در مقالاتی که شامل ایمونوهیستوشیمی در این مجلات بودند قابل‌شناسایی هستند.ما همچنین دستورالعمل‌هایی را برای نویسندگان تمام مجلات انتخابی بررسی کردیم.از ۱۰۰ مقاله در نه مجله، تا ۸۰ % مقالات به کنترل ها اشاره نمی‌کنند و ۸۹ % دستورالعمل‌های نویسندگان برای این مجلات نیازی به کنترل ندارند و یا حتی به آن اشاره نمی‌کنند.

این نظرسنجی غیررسمی یک دلیل را روشن می‌سازد که کنترل‌ها اغلب از نشریات حذف می‌شوند:

مجلات (و به طور استنباطی، داوران و سردبیران آن‌ها)یا اصول اساسی کنترل ایمونوهیستوشیمی را درک نمی‌کنند و یا آن را به اندازه کافی مهم نمی‌دانند که نیاز به گنجاندن در مقالات خود داشته باشند.
این متاسفانه بر محققان تاثیر می گذارد تا نگرش غیر قانونی نسبت به استفاده از کنترل های معتبر در مطالعات خود داشته باشند.
بر این اساس ، ما توصیه می کنیم که دستورالعمل های مربوط به نویسندگان برای همه مجلات باید شامل الزامی باشد که باید کنترل ها را توصیف کرده و در نسخه های خطی گنجانده شود که نتایج مطالعات ایمونوهیستوشیمیایی را گزارش می کند.برای جلوگیری از نتیجه گیری نادرست در مورد یک نتیجه مثبت کاذب یا منفی کاذب ، باید حداقل یک کنترل مثبت و منفی برای همه ی سنجش های ایمونوهیستوشیمیایی اجرا شود.علاوه بر این مجلات و ویراستاران آن ها باید از داوران بخواهند تا درباره استفاده از حداقل کنترل های مثبت و منفی مناسب اظهار نظر کنند.در اینجا ما به طور خلاصه این کنترل ها و نحوه ی تفسیر صحیح آنها را شرح می دهیم.
ویژگی آنتی بادی
برای تفسیر معتبر رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی ، انتخاب آنتی بادی هایی است که برای تشخیص اپی توپ های خاص تایید شده اند.این موضوع شاید مهمترین کنترل باشد و به طور گسترده در جاهای دیگر مورد بحث قرار می گیرد.مورد اختصاصی بودن اغلب مستقل از اتصال به اپی توپ در بافت ها یا سلول ها ایجاد می شود.این معمولا شامل جداسازی پروتئین هایی است که با استفاده از الکتروفورز ژل از نظر اندازه ، بار یا ترکیب متفاوت هستند.سپس پروتئین ها از ژل به غشایی (به عنوان مثال وسترن بلات)منتیل می شوند ، جایی که آنها با یک آنتی بادی و یا آنتی بادی های مخصوص پروتئین هدف رنگ آمیزی می شوند تا مشکل واکنش متقابل آنتی بادی ها را برطرف کنند.اگرچه این ویژگی معمولا توسط سازنده آنتی بادی ارائه می شود، در حالت ایده آل پروتئین های جداشده در وسترن بلات باید از همان بافت یا سلول هایی به دست آیند که آنتی بادی برای ایمونوهیستوشیمی استفاده می شود.مورد دوم اغلب برای یک محقق امکان پذیر نیست اما با این وجود محقق باید بداند که این معنی از ویژگی فقط در مورد خاصیت آنتی بادی ها (چه پلی کلونال یا مونوکلونال)برای تشخیص اپی توپ های خاص صدق می کند ، اما هویت اتصال را ثابت نمی کند .یک مولکول هدفمند رنگ آمیزی در یک نمونه بافت.متاسفانه به اصطلاح کنترل جذب اغلب به طور نادرست به عنوان یک کنترل منفی به عنوان پشتیبانی از ویژگی رنگ آمیزی ایمنی یک مولکول هدفمند ارائه می شود.این روش با مخلوط کردن آنتی بادی با پروتئین هدف قبل اعمال آنتی بادی روی برش بافت انجام می شود.اگر رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی دربافت توسط این روش مسدود شود ، رنگ آمیزی مشاهده شده با آنتی بادی جذب نشده اغلب اختصاصی در نظر گرفته می شود.
با این حال این نتیجه فقط نشان می دهد که آنتی بادی برای مولکولی که برای آن تولید شده است خاص است – واقعیتی که قبلا توسط وسترن بلات نشان داده شده است – اما نشان نمی دهد که آنتی بادی به همان مولکول هدف در بافت متصل می شود.متاسفانه باتوجه به نیاز به کنترل ها ، داوران اغلب درخواست کنترل های جذب می کنند اما این نتیجه (یعنی مسدود کردن رنگ آمیزی ایمنی)یک کنترل ضعیف برای نتیجه گیری در مورد هویت مولکول های هدف در بافت است.
کنترل های مثبت
کنترل های مثبت در پروتکل های ایمونوهیستوشیمی، نمونه هایی حاوی مولکول هدف در مکان شناخته شده آن هستند (به عنوان مثال، نوع سلول خاص ، محفظه درون سلولی ، در میان سایر موارد )و هیستومورفولوژی و سیتومورفولوژی آن ها را می توان با یک لکه (یعنی فلوروکروکرومیک مولکول ها)مشاهده کرد.به طور کلی این ویژگی ها در ابتدا از سایر شواهد تجربی، از جمله وسترن بلات، بیان بیش از حد، آزمایش بر روی سلول ها، یا مطالعات انجام شده بر روی حیوانات تراریخته که مولکول هدف را بیان می کنند ، استنباط می شوند.برعکس آنتی بادی نباید در موش های دستکاری شده ژنتیکی که در آن مولکول هدف حذف شده است، رنگ آمیزی ایجاد کند.
به طور کلی، استفاده از رده های سلولی، به ویژه آنهایی که برای بیان بیش از حد یک هدف منتقل می شوند ، به عنوان کنترل های مثبت مناسب توصیه نمی شوند، زیرا بسیاری از سنجش ها فاقد محدوده دینامیکی و کالیبراسیون مناسب برای اطمینان از مقایسه مناسب بین یک رده سلولی و بافت هستند.
دقیق ترین کنترل مثبت، کنترل آناتومیکی مثبت است.یعنی جایی که وجود آنتی ژن در نمونه از قبل مشخص است و هدف درمان تجربی نیست.این می تواند محل بیان مولکول هدف در نمونه (به عنوان مثال ، کنترل مثبت داخلی)یا یک نمونه جداگانه (به عنوان مثال، یک اسلاید)باشد که حاوی مولکول مورد هدف آنتی بادی است (به عنوان مثال، کنترل خارجی مثبت).برای مثال، سنجشی که از آنتی بادی استفاده می کند که ادعا می شود برای انسولین اختصاصی است ، باید بخش هایی از پانکراس را شامل شود که جزایر لانگرهانس دارند.آنتی بادی باید تنها سلول های بتا جزایر تولید کننده انسولین را هدف قرار داده و آنها را تجسم کند.باید نشان داده می شد که این آنتی بادی با مولکول های نزدیک به خانواده پپتیدهای شبه انسولین واکنش متقابل نشان نمی دهد.تفسیر کنترل های مثبت می تواند در مورد آنتی بادی هایی که علیه مولکول هایی که در همه جا بیان می شوند یا در سطوح بسیار پایین بیان می شوند، مشکل ساز باشد و این معیار برای اختصاصیت ممکن است در تنظیمات بالینی غیر ممکن باشد.با این وجود در غیاب چنین کنترل هایی ، محقق موظف است (ومجلات باید بخواهند)که نویسندگان در مورد تفاسیر حاصل از چنین سنجش هایی محتاط باشند.
کنترل های منفی
هدف از یک کنترل منفی نشان دادن این است که واکنش مشاهده شده به دلیل برهمکنش اپی توپ مولکول هدف و پاراتوپ معرف آنتی بادی / میل ترکیبی است. برای محققین بسیار مهم است که نسبت به ادعاهای مطرح شده در مورد ویژگی آنتی بادی های مورد استفاده برای ایمونوهیستوشیمی، به ویژه برای آنتی بادی های به دست آمده از منابع تجاری، محتاط باشند. اگرچه یک تولید کننده ممکن است ویژگی یک آنتی بادی را با تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان دهد، نمی توان نتیجه گرفت که ایمونوهیستوشیمی با همان آنتی بادی، مولکول هدف یکسان را در نمونه بافت نشان می دهد. بنابراین، علاوه بر مولکول مورد هدف آنتی بادی، نتایج یک سنجش ایمونوهیستوشیمی (به عنوان مثال، “لکه”) می تواند حضور مولکول های ساختاری مرتبط و همچنین اتصال آنتی بادی های مورد استفاده در سنجش (هم اولیه و هم ثانویه) را آشکار کند. ) غیر اختصاصی برای سایر اجزای سلولی و بافتی. بر این اساس، مجلات باید از نویسندگان بخواهند که نشان دهند (یا به شواهدی استناد کنند) که آنتی بادی پروتئینی را در بافت مورد نظر تشخیص می‌دهد که به طور مناسب در الکتروفورز ژل مهاجرت می‌کند و با آنتی‌بادی‌های مخصوص پروتئین هدف رنگ می‌شود، همانطور که توسط وسترن بلات نشان داده شد.
متأسفانه، یک “کنترل منفی” رایج که در بسیاری از مقالات در ادبیات دیده می شود، انجام روش ایمونوهیستوشیمی با یک آنتی بادی اولیه در پشت سر هم با نمونه ای است که در معرض آنتی بادی اولیه قرار نگرفته است. یعنی با حذف آنتی بادی اولیه. محققین ادعا می کنند – و متأسفانه، داوران و ویراستاران مجلات می پذیرند – این به عنوان کنترلی برای ویژگی رنگ آمیزی برای آنتی ژن مورد هدف آنتی بادی است. این یک خطای عمیق است. عدم وجود رنگ آمیزی در هنگام حذف آنتی بادی اولیه ، کنترلی برای اتصال غیراختصاصی آنتی بادی ثانویه است. این نتیجه شواهدی برای اختصاصی بودن رنگ آمیزی با آنتی بادی اولیه نیست. با این حال، در برخی موارد، یک کنترل اضافی مهم در توسعه سنجش است. بین رنگ‌آمیزی که از اتصال ایمونوگلوبولین‌ها در محل‌های اتصال آنتی‌ژن در مناطق متغیر F(ab)2 (به عنوان مثال، ضمنی برای “اتصال اختصاصی” و ایمونوگلوبولین‌ها در تعامل با اجزای سلولی و بافتی در ناحیه Fc ایجاد می‌شود) یا به دلیل مکانیسم های غیراختصاصی تمایز قائل نمی‌شود. مکانیسم ها کنترل منفی مناسب در این مورد جایگزینی ایمونوگلوبولین های اختصاصی سرم یا ایزوتیپ خاص با همان غلظت پروتئین آنتی بادی اولیه است.
متأسفانه، استفاده از ایمونوگلوبولین های اختصاصی ایزوتیپ (یا سرم “طبیعی” یا “پیش ایمنی”) به عنوان جایگزینی برای آنتی بادی اولیه به عنوان یک کنترل منفی برای ویژگی رنگ آمیزی از بین رفته است. در نمونه آنتی بادی پلی کلونال غیرتجاری، باید از سرم های پیش ایمنی استفاده شود، و زمانی که سرم های پیش ایمنی در دسترس نیست (آنتی بادی های پلی کلونال تجاری و همه آنتی بادی های مونوکلونال) باید ایمونوگلوبولین اختصاصی ایزوتیپ به طور مناسب جایگزین شود. این کنترل باید حداقل نیاز مطلق مجلات برای انتشار مطالعاتی باشد که ایمونوهیستوشیمی را در بر می گیرند. با این حال، باید درک کرد که به اصطلاح «آنتی بادی‌های اختصاصی»، هم پلی کلونال و هم مونوکلونال، می‌توانند به‌دلیل اتصال به Fc و مکانیسم‌های دیگر به‌طور غیر اختصاصی متصل شوند، که منجر به این احتمال می‌شود که هم رنگ‌آمیزی اختصاصی و هم غیراختصاصی با چنین آنتی‌بادی مشاهده شود. در یک بخش بافتی نمی‌توان بدون کنترل‌های بیشتر به طور معتبر تشخیص داد (به عنوان مثال، برخی از رنگ‌آمیزی‌ها اختصاصی و برخی غیراختصاصی هستند). در این شرایط (جایی که به نظر می رسد آنتی بادی اولیه اتصال غیر اختصاصی را نشان می دهد)، یک کنترل جذب می تواند در تشخیص رنگ آمیزی اختصاصی از غیر اختصاصی مفید باشد. رنگ‌آمیزی که هنگام استفاده از آنتی‌بادی جذب‌شده وجود ندارد (در زمینه رنگ‌آمیزی مداوم و غیر اختصاصی) احتمالاً محل اتصال آنتی‌بادی خاصی را نشان می‌دهد.

استاندارد های عمل برای ایمونوهیستوشیمی
با توجه به اینکه حذف یا استفاده نادرست از کنترل ها یک مشکل جدی است که اعتبار و همچنین تکرارپذیری بسیاری از داده های منتشر شده حاصل از استفاده از ایمونوهیستوشیمی را محدود می کند، توصیه می کنیم مجلات زیست پزشکی الزامات خاصی را در مورد گنجاندن کنترل های ایمونوهیستوشیمی در دستورالعمل های خود لحاظ کنند. برای نویسندگان، به عنوان عنصری برای توصیف سنجش های ایمونوهیستوشیمی. دستورالعمل های ذکر شده در این مقاله اولین گام در تعریف استاندارد عمل برای ایمونوهیستوشیمی است. مقالات اضافی نکات بیشتری را که باید برای اطمینان از اعتبارسنجی و توصیف کافی سنجش‌های ایمونوهیستوشیمی مورد توجه قرار گیرد، تشریح خواهند کرد. محصول نهایی این تلاش بزرگتر یک نسخه خطی یکپارچه خواهد بود که مشخصات سنجش های ایمونوهیستوشیمی را در متون بررسی شده تشریح می کند و مقالات جداگانه به عنوان اطلاعات عمیق در مورد هر یک از این نکات خدمت می کنند.
اگرچه تکرارپذیری یک نگرانی است، اعتبار نتایج گزارش شده مشکل جدی تری است. یافته‌های با آنتی‌بادی ضعیف می‌توانند نتیجه‌گیری‌های تکرارپذیر، اما نامعتبر، در صورت عدم وجود کنترل‌های مناسب ایجاد کنند. تکرارپذیری زمانی می‌تواند به یک مشکل تبدیل شود که آنتی‌بادی‌های مختلف در برابر یک آنتی‌ژن نتایج متفاوتی تولید کنند و کنترل‌ها برای مرتب کردن اعتبار یافته‌های مختلف وجود نداشته باشد. در جدول ۱، عناصری را با اشاره به کنترل‌هایی که سردبیران مجلات باید در دست‌نوشته‌های ارائه‌شده‌ای که داده‌های ایمونوهیستوشیمی را گزارش می‌کنند گنجانده شوند، تشریح می‌کنیم. نتایج یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی و همچنین داده هایی که از ویژگی ادعا شده آنتی بادی های اولیه برای مولکول های هدف حمایت می کنند باید گزارش شوند.

• جدول ۱

عناصر ضروری مربوط به کنترل‌ها در سنجش‌های ایمونوهیستوشیمیایی که باید در نسخه‌های خطی بررسی شده گنجانده شوند.

1. مستندات یا مراجعه به وسترن بلات که اتصال آنتی‌بادی را تائید می کند:اتصال آنتی‌ژن برای تشخیص بیومولکول هدف با اندازه مولکولی مناسب در لیزات سلولی را تأیید می‌کند (که در شرایط آزمایشگاهی سنتز نشده یا فقط دارای ایمونوژن نیست).
2. بیانیه روشنی در مورد ماهیت کنترل مثبت ایمونوهیستوشیمی که انجام شد.
3. بیانیه روشن در مورد ماهیت کنترل منفی ایمونوهیستوشیمی که انجام شد.
   الف. کنترل های منفی باید با سرم های پیش ایمنی یا ایزوتیپ اختصاصی انجام شود.
   ب. کنترل های منفی که فقط آنتی بادی اولیه را حذف می کنند به خودی خود ناکافی هستند.
4. استفاده از کنترل های دستکاری شده ژنتیکی و همچنین siRNA با تایید PCR می تواند به عنوان کنترل های مثبت و منفی عمل کند.
5. استفاده از ابزارهای جایگزین کنترل، از جمله “کنترل های جذب” برای نشان دادن ویژگی ناکافی است.

توصیه های اضافی در مورد سنجش های ایمونوهیستوشیمی در مقالات اضافی در این مجموعه تعریف خواهد شد.

مشخص کردن ویژگی آنتی ژن-آنتی بادی باید بر تأیید رابطه یک پروتئین متکی باشد:

رابطه یک آنتی بادی یا تعیین حضور اپی توپ های مشترک.

هنگامی که اپی توپ های مشترک وجود دارد، کنترل های اضافی ضروری است.

رویکردهایی مانند “کنترل جذب” و حذف یک آنتی بادی اولیه هرگز نباید به عنوان تنها کنترل منفی برای ویژگی رنگ پذیری در غیاب اظهارات روشن توسط نویسندگان مبنی بر اینکه این کنترل ها به طور واضح ویژگی رنگ آمیزی را نشان نمی دهند، پذیرفته شوند.

نکات ذکر شده در جدول ۱ می تواند توسط نویسندگان به عنوان پشتیبانی از اعتبار تفسیرهای ایمونوهیستوشیمی گزارش شده در انتشارات آنها ذکر شود.

ترجمه: آیدا خسروی

ممنونیم که تا آخر این مقاله با ما همراه بودید.خیلی خوشحال می‌شویم نظرات خود را زیر همین مقاله برای ما ارسال کنید و درصورتی که تجربه خرید از مجموعه نیاز طب سلامت دارید، تجربه خود را با ما در میان بگذارید.

برای بررسی و خرید تجهیزات آزمایشگاه پاتولوژی می‌توانید به بخش پاتولوژی ایمونوهیستوشیمی و سیتولوژی و دیوار نیازطب در سایت نیازطب سلامت مراجعه کنید.

ما در پیج اینستاگرام مجموعه نیاز طب، تجهیزات آزمایشگاهی مختلفی را مورد بررسی قرار میدهیم. با دنبال کردن این پیج می‌توانید اطلاعات خوبی در زمینه تجهیزات آزمایشگاهی کسب کنید.

می‌توانید به راحتی با شماره تلفن ۰۹۹۲۴۸۷۰۰۳۸ تماس حاصل فرمایید و سوالات خود را از کارشناسان ما بپرسید.